定量的マルチプレックスRTの開発

Scientific Reports volume 13、記事番号: 12073 (2023) この記事を引用

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メトリクスの詳細

デルタ型肝炎は、B 型肝炎 (HBV) および D 型肝炎 (HDV) ウイルスへの曝露によって引き起こされる疾患で、通常、HBV 単独感染と比較した場合、より重篤な臨床転帰を伴います。 現在までのところ、HDV 感染症の実際の有病率は過小評価されており、特に流行地域では検出方法が十分に利用できません。 したがって、HDV-RNA を定量化するためのワンステップ RT-qPCR 法が開発されました。 生物学的サンプルは、2017年から2023年の間に、ロンドニア熱帯メディカルセンターの肝炎ウイルス外来患者および専門支援サービスの患者から選択され、この研究によって開発された検査と2回目の定量的RT-qPCRアッセイを受けました。 最初の定量アッセイの傾きは - 3.321 で、効率は 100.04%、増幅率は 2 でした。再現性データの分析により、定量限界は 5 コピー/反応、検出限界 (95%) は 2.83 コピー/反応であることが明らかになりました。反応。 診断感度テストでは、参照テストと比較して 97.37% の精度がありました。 このアッセイは非常に効率的で再現性があることが証明されており、デルタ型肝炎患者をモニタリングし、疾患進行のリスクや治療の有効性を評価するための貴重なツールとなっています。

デルタウイルス属に分類されるデルタ肝炎ウイルス (HDV) は非定型で、サイズが 36 ～ 43 nm の負極性 RNA の一本鎖約 1,700 ヌクレオチドを示し、その外部構造には B 型肝炎ウイルス (HBV) の表面タンパク質が存在します。 )1、2。 HDV 感染は、HBV への以前の曝露、現在または同時に HBV に感染していることが先行します。 通常、その臨床転帰はより重篤であり、HBV 単独感染と比較した場合、肝硬変または肝細胞癌への進行の加速が特徴です 3,4,5。

現時点では、HDV の世界的な蔓延を正確に推定することは困難です。 少なくとも1,200万人から1,500万人がウイルスに感染している可能性があり、アフリカ、アジア、南北アメリカ、東地中海、ヨーロッパに分布しています6,7。 南米では、HDV の流行地域は北部 (アマゾン流域地域) に位置し、複数の国に及んでいます5、8、9、10。 ブラジルでは、2000 年から 2021 年の間に報告された症例数は 4,259 件でした。 この病気は国中で無視されたままであり、重複感染を判断するための HBV 単独感染患者の積極的な検索が行われていないため、これらの数字は過小報告されていると考えられます 11。

HDV 感染の血清学的診断は、血清中の総抗 HDV 抗体の検出に基づいています。 肝組織内の HDAg の存在は、肝線維化の程度を評価できる非侵襲的で痛みのない方法である肝エラストグラフィーによる感染の確認を可能にする臨床指標でもあります 4,12。 抗 HDV 抗体が検出されると、分子診断を使用して活動性感染を確認または除外します。 分子検査は、血漿中の HDV RNA を検索することによって実行され、RT-qPCR 法によって定量されます。 ただし、ブラジル健康監視局 (Anvisa) に登録されたキットがないため、これは従来型ではありません。 専門の専門家が社内テストを開発できる限られた領域で HDV を定量化するための分子的手法の使用も制限要因です 13。

したがって、アマゾン地域の風土病地域では HDV 分子診断が広く利用されていないため、HDV 分子診断は依然として課題となっています。 研究の目的は、デルタ型肝炎患者の診断と追跡のための高感度定量的マルチプレックス ワンステップ RT-qPCR アッセイを開発することでした。

増幅効率と直線性を決定するために、反応ごとに 1 × 105 および 1.25 コピーの間隔 (1 × 105、1 × 104、1 × 103、1 × 102、1 × 101、5、2.5 e 1.25) でプラスミドをテストしました。 反応あたり 5 コピーを超える定量曲線上のすべての点は、さまざまなアッセイで 100% の増幅を示しました。 最初の定量テストの傾きは - 3.321、効率は 100.04%、直線の相関係数 (R2) は 0.99、増幅率は 2 でした (図 1 を参照)。